Atividade Ezimatica

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

1 OBJETIVO Compreender os significados bioquímicos da Constante de Michaelis-Menten e avaliar a atividade enzimática das enzimas bromelina e amilase em diferentes meios.

2 INTRODUÇÃO O Trabalho Acadêmico a ser apresentado é uma análise de dois experimentos: O primeiro estudado apenas teoricamente; E o segundo executado no laboratório de Química, no dia 21/05/2010, orientados pela professora Rosemary Pimentel.

3 REVISÃO DE LITERATURA Os organismos vivos são formados por coleções de moléculas inanimadas que interagem entre si. O objetivo básico da Bioquímica é mostrar como essas coleções de moléculas inanimadas interagem entre si, mantendo e perpetuando os organismos vivos(animados), através da químicas aplicada a um nível molecular. Para a Bioquímica, todos os organismos vivos(animados) são semelhantes em níveis moleculares e químicos. Assim, ela descreve as estruturas, mecanismos e processos químicos compartilhado por todos os seres existentes (inanimados e animados), comparando-os em termos moleculares, formulando princípios organizacionais que fundamentam a Lógica Molecular da Vida. Um dos princípios organizacionais da Bioquímica é a hierarquia molecular. Os seres vivos são constituídos por células com diferentes funções. Todas as células, por sua vez, possuem uma estrutura hierárquica semelhante: As células são divididas em complexos supramoleculares; Estes complexos são subdivididos em macromoléculas constituídas de biomoléculas, formadas a partir de subunidades monoméricas. Existem quatro principais grupos de macromoléculas: Lipídios, carboidratos, ácidos nucléicos e proteínas.

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As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células vivas. Elas ocorrem em todas as células e em todas as partes destas. As proteínas também ocorrem em grande variedade; [.] as proteínas também exibem uma grande diversidade de funções biológicas, sendo os produtos finais mais importantes das vias de informação [.]. Em um sentido, são os instrumentos moleculares por meio dos quais a informação genética é expressa. (LEIHNINGER, 2002. p. 89)

Dentre tantos papéis desempenhados pela proteína, encontra-se o de catálise. A catálise é a capacidade que um composto tem de acelerar uma reação num determinado substrato ( fonte de alimentação da reação). As moléculas de proteínas que atuam como catalisadoras são chamadas de enzimas, ou biocatalisadores. A atividade enzimática foi estudada por Leonor Michaelis e Maus Menten, em 1913, dividindo o processo em duas etapas que podem ser descritas conforme a equação a seguir:

[.] inicialmente a enzima se combina reversivelmente com o substrato para formar o complexo enzimasubstrato, em um passo reversível relativamente rápido. [.] Em uma segunda etapa lenta, o complexo ES então se quebra liberando a enzima livre, o produto da reação, P. [.] (LEIHNINGER, 2002. p. 199)

Além de estudar o processo envolvido durante a reação, Michaelis e Menten criaram uma constante combinando: A velocidade inicial e máxima de conversão do substrato em produto; a concentração de enzima; e a concentração do substrato na solução. Ou seja: Quando a concentração do substrato alcança a metade da velocidade máxima, encontramos a constante. Vale ressaltar que a constante de Michaelis-Menten tem como papel fundamental prever a quantidade de substrato e enzima para que a reação seja eficaz. Abaixo, segue a fórmula matemática da constante: Km = k2 + k3k1 Km: Constante de Michaelis-Menten; k1: Enzima e Substrato formando Complexo Enzima-Substrato; k2: Complexo Enzima-Substrato formando Enzima e Produto; k3: Reação reversível Complexo Enzima-Substrato formando Enzima e Substrato.

(1)

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Após observar as etapas da atividade enzimática, Michaelis e Menten criaram gráficos para identificar a posição da constante:

TÍTULO: CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO x VELOCIDADE DA REAÇÃO FONTE: CINÉTICA ENZIMÁTICA A partir dos valores da velocidade V e concentração do substrato [S] encontrados no experimento, é possível desenvolver outro gráfico que assuma uma trajetória linear, basta inverter matematicamente os valores:

TÍTULO: DUPLI-RECÍPROCO FONTE: CINEMÁTICA ENZIMÁTICA As enzimas são específicas para seus substratos, e o reconhecimento do substrato pela enzima é altamente eficiente. (MASTOTROENI; GERN, 2008. p. 59) Por conta disso, existem fatores que podem influenciar a ação enzimática. São eles:

Temperatura: A temperatura crítica para uma enzima é aquela na qual a conformação da molécula é alterada, levando a desnaturação protéica em consequente perda da fun-

ção catalítica (MASTOTROENI; GERN, 2008. p. 56.);

pH: Enzimas funcionam bem dentro de uma faixa de pH ótimo, abaixo e acima da qual a velocidade da reação diminui (MASTOTROENI; GERN, 2008. p. 57);

Concentração de enzimas: Quanto maior a concentração de enzimas, maior a velocidade da reação (MASTOTROENI; GERN, 2008. p. 57); Concentração de Substrato no meio; Inibidores ou ativadores: Moléculas que se ligam às enzimas, mudam sua conformação, favorecendo ou não o aumento da velocidade (MASTOTROENI; GERN, 2008. p. 57).

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4 EXPERIMENTO 1: DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE MICHAELISMENTEN(Km) E DA VELOCIDADE MÁXIMA(Vmáx) PARA A INVERTASE DE LEVEDURA O presente experimento foi estudado apenas teoricamente por carência de aparelhagem e reagentes no laboratório do núcleo de Marabá Universidade do Estado do Pará (UEPA). Visto o impasse, os procedimentos experimentais do experimento serão apresentados juntamente com os significados bioquímicos gerais do mesmo. 4.1 MATERIAL E MÉTODOS 4.1.1 Equipamentos e Vidrarias

Espectrofotômetro Estante com 8 tubos de ensaio (por grupo) 2 pipetas graduadas de 2 mL (por grupo) 1 pipeta graduada de 1 mL (por grupo) 1 pipeta volumétrica de 1 mL (por grupo) Centrífuga e banho-Maria para dosagem de açúcares redutores

4.1.2 Reagentes

4 g de fermento prensado tipo Fleischmann Reagente de Somogyi Reagente de Nelson Padrão de açúcar redutor (100 ug de glicose por 2,5 mL) Substrato (sacarose 12,5 mM = 4,27 g/L)

4.1.3 Procedimento Experimental I) Extração da enzima

Transferir 4 g de fermento de panificação para tubo de centrífuga, adicionar 20 o mL de água destilada e deixar em estufa a 37 C por 30 minutos agitando

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casualmente. Centrifugar a 1.000 x g 1:200 (a critério do professor). II) Ensaio enzimático

por 15 minutos recolhendo o

sobrenadante que contém a enzima invertase. Fazer uma diluição de 1:100 ou

Pipetar os volumes (em mL) das soluções em 8 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 7, conforme indica o quadro que se segue:

Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 Sacarose 12,5mM 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,0 2,5mL de padrão contendo Água 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 0,5 100ug de glicose Invertase Diluída 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 TABELA1: VALORES DE CONCENTRAÇÕES PARA AS SOLUÇÕES

o Incubar os tubos (exceto o tubo no 7) a 37 C, por 15 minutos, para que a invertase catalise a hidrólise da sacarose, resultando na formação de glicose e frutose (açúcares redutores), os quais podem ser determinados pela reação de Somogyi-Nelson.

III) Reação para dosagem de açúcares redutores.

Após o período de incubação acrescentar 1 mL do reativo de Somogy (a reação enzimática é paralisada pela desnaturação da invertase, quer pela ação do Cu+ ou pela alcalinidade do reagente).

TUBO (NO) 0 1 2 3 4

Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos, resfriá-los e juntar 1 mL do reativo de Nelson. Agitar, completar o volume a 10 mL (adicionando 5,5 mL de água destilada), agitar novamente a fazer leitura a 530 nm. Registrar suas observações.

T% 530 nm D.O. 530 nm D.O. 530 nm [S]* 0 mM 2 mM 4 mM 6 mM 8 mM V* 1 [S] 0,500 0,250 0,167 0,125 1 V

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5 6 7

10 mM

0,100

TABELA 2: REGISTROS 4.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO

I)

Preencher a tabela.

Por conta da ausência do espectrofotômetro, não foi possível encontrar os valores de Transmitância, Densidade Ótica e, consequentemente, de velocidade.

II)

Transformar as leituras de densidade ótica em quantidades de açúcar redutor.

As quantidades de açúcares redutores dependem do valor das densidades óticas, os quais não foram encontrados por carência do Espectrofotômetro.

III)

Calcular as velocidades de reação V para cada tubo. Com os dados construir os seus gráficos V em função de [S] e 1/V em função de 1/[S].

Não foi possível quantizar os valores de velocidade, pois o experimento não foi realizado na prática. Mas a teoria mostra que os gráficos V x [S] e 1/V x 1/[S] ficariam da seguinte maneira: V x [S]

IV)

1/V x 1/[S]

Determinar analiticamente os valores de Km e Vmáx e discutir os seus significados bioquímicos.

A constante de Michaelis-Menten (Km) é a concentração do substrato quando a velocidade atinge metade de seu valor máximo. Não foi possível quantizar os valores de velocidade, pois o experimento não foi realizado na prática, consequentemente, o valor de Km também não foi encontrado. Km sempre assume um valor entre 0 e 1; Quanto mais próximo de 0 for Km, mais eficaz é a afinidade das enzimas com o substrato, logo, o tempo da reação é melhor aproveitado e o desperdício de substrato é menor.

V)

Explique o que ocorre nos tubos 0 e 6 comparando os resultados obtidos no experimentos.

O experimento não foi realizado na prática, por isso não foi possível observar o que ocorreria com os tubos.

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5 EXPERIMENTO 2: AÇÃO ENZIMÁTICA EM CARBOIDRATOS E PROTEÍNAS 5.1 MATERIAL E MÉTODOS 5.1.1 Equipamentos e vidrarias

Erlenmeyer; Tubos de ensaio; Pipeta volumétrica; Béquer; Espátula; Vidro de relógio; Funil;

5.1.2 Reagentes

Folha de gelatina incolor (2cm ); Pedaços de papel crepom; Solução de Maisena; Extrato de abacaxi; Saliva; Bicarbonato; Vinagre; Água destilada.

5.1.3 Procedimento Experimental I) Preparou-se as fontes de enzimas

Liquidificou-se quatro fatias de abacaxi, congelou-se e descongelou-se a polpa e filtrou-se 5ml do extrato em papel de filtro; Coletou-se 2ml de saliva.

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II) Preparou-se a fontes de substrato

Cortou-se 6 pedaços com 2cm de gelatina em folha, diluindo-as em 60ml de água colorada com papel crepom em 6 tubos de ensaio; Diluiu-se 200ml de maisena em 40ml de água num erlemneyer, levou-se ao aquecimento até que a solução levantasse as primeiras bolhas de fervura e deixou-se esfriar até a temperatura ambiente e distribuiu-se a solução em 3 tubos de ensaio.

III) Misturou-se as fontes de enzima com as fontes de substratos

Dispôs-se dos 3 primeiros tubos de ensaio contendo a água colorada com papel crepom, cada um contendo 10ml. Pipetou-se 1ml de extrato de abacaxi no primeiro tubo, 1ml de saliva no segundo tubo, 1ml de água no terceiro tubo e levou-se os três tubos ao banho-maria rapidamente por 15min com temperatura de 30ºC;

Dispôs-se dos 3 tubos de ensaio contendo a solução de maisena. Pipetou-se 1ml de extrato de abacaxi no primeiro tubo, 1ml de saliva no segundo tubo, 1ml de água no terceiro tubo e levou-se os três tubos ao banho-maria rapidamente por 15min com temperatura de 30ºC;

Dispôs-se dos 3 tubos de ensaio restantes contendo água colorada com papel crepom, cada um contendo 10ml. Pipetou-se 1ml de abacaxi em todos os 3 tubos. Logo após, pipetou-se 1ml de vinagre, uma colher rasa de bicarbonato de sódio e levou-se os três tubos ao banho-maria rapidamente por 15min com temperatura de 30ºC;

2. RESULTADOS E DISCUSSÕES

As enzimas utilizadas no presente experimento foram bromelina, presente no abacaxi e amilase, presente na saliva. As fontes utilizadas foram proteína, presente na gelatina, e amido, presente na maisena. Não foi encontrada gelatina em folha com a coloração vermelha. Para sanar a deficiência, a concentração de água foi colorada com papel crepom de cor vermelha. A

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coloração na solução foi necessária para que pudéssemos observar e comparar os resultados em relação à turbidez da amostra. Antes de fazermos o experimento, congelamos a polpa de abacaxi, o que preservou as enzimas bromelina ativas durante 6 dias. Para cada etapa de avaliação da atividade enzimática em substratos diferentes, foi feita uma amostra padrão, para que pudéssemos comparar os experimentos com e sem a alteração n o meio. A ação enzimática evidenciou, em todos os experimentos, que a enzima bromelina foi mais eficiente do que a enzima amilase. As soluções que continha enzimas de abacaxi, a solução ficou bastante turva em relação à solução que continha enzimas de saliva. Ou seja, as enzimas do abacaxi possuem a constante de Michaelis-Menten mais próxima de 0 que as enzimas de amilase. Na última fase do experimento, o pH de dois tubos de ensaio foi alterado com o acréscimo de um ácido(vinagre) e um sal(bicarbonato). Por conta disso, as enzimas ficaram inativas e a reação catalítica não ocorreu. Os resultados obtidos estão demonstrados na tabela a seguir: Fonte de Enzima 1 Gelatina(proteína) Abacaxi(bromelina) 1 2 Gelatina(proteína) Saliva(amilase) 3 Gelatina(proteína) Água 1 Maisena(amido) Abacaxi(bromelina) 2 2 Maisena(amido) Saliva(amilase) 3 Maisena(amido) 1 Gelatina(proteína) Abacaxi(bromelina) 3 2 Gelatina(proteína) Abacaxi(bromelina) + Vinagre(ácido) 3 Gelatina(proteína) Abacaxi(bromelina) + Bicarbonato(sal) TABELA 3: COMPARAÇÃO DOS EXPERIMENTOS Etapa Tubo

6. 7. CONCLUSÃO

Fonte de Substrato

Turbidez

Os objetivos do Experimento 1 não foram completamente atingidos pela carência de aparelhagens e reagentes. Então, respondemos às questões teóricas. Os objetivos do Experimento 2 foram completamente atingidos. Nota-se uma eficiência catalítica admirável das enzimas devido ao seu alto grau de especificidade por seus substratos, acelerando reações químicas específicas. Observa-se que

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tais reações ocorrem em condições necessárias para que ocorra uma boa atividade da enzima, já que elas funcionam em condições suaves de temperatura e pH. Vale ressaltar que o bom conhecimento da estrutura das enzimas e suas condições de funcionamento são de fundamental importância uma vez que a indústria farmacêutica utiliza os parâmetros de atividade enzimática para potencializar os efeitos dos medicamentos.